戊戌变法失败后，光绪皇帝被慈禧太后囚禁。光绪皇帝在度过了10年没有人身自由的囚徒生活后，于光绪三十四年十月二十一日(1908年11月1日)死亡，终年三十八岁。
紧接着，第二天，即光绪三十四年十月二十二日，慈禧太后在仪鸾殿死亡。
在22小时之内，这对母子相继去世，死亡时间的诡异与巧合，光绪帝与慈禧之间早已存在的政治矛盾，不得不让人感觉，光绪帝的死亡背后，深藏着一个惊心而巨大的阴谋。由此，繁衍出种种猜测和议论。
第一种说法：慈禧知道自己即将归西天，不愿意在他死后，光绪皇帝重新掌权，派人毒死了光绪帝。主要依据有清末给光绪看病的名医屈桂庭他的回忆录中说：“光绪在临死前三天，在床上不停地翻滚，并且不停地大叫，‘肚子疼得不得了。’脸色发暗，舌头又黄又黑，明显是中毒症状。”根据这种说法，光绪是被毒死的，最大的嫌疑人是慈禧太后，因为她是当时最有权势，又严密控制光绪帝的，最好下毒、最可能下毒的人。
此说法的依据和记录有《清室外记》《清裨类钞》和《崇陵传信录》。
第二种说法：袁世凯见慈禧一病难起，怕慈禧死后，光绪掌握实权，报复自已在戊戌变法出卖皇帝的行为，于是贿赂宫廷宦官，用剧毒药物害死光绪帝。这种说法最有权威的依据是清朝最后一个皇帝溥仪的说法，溥仪说：“我亲耳听到一个侍候光绪帝的老太监讲，光绪帝死前一天，只是用了一剂药，才变坏的。后来才知道这剂药是袁世凯送的。
第三种说法：太监李莲英得悉光绪帝的日记中载有西太后死后将诛袁世凯和他的消息，与慈禧一起阴谋将毒药投入光绪的食物中致使光绪帝中毒身亡。
第四种说法：这几年来有专家根据光绪帝生前的病历，结合当时的历史背景和现代中医学理论，推断是光绪帝因为严重肺结核病加上其他并发症，导致死亡的。
历史背景的根据是光绪二十五年正月初二日，太医朱琨等为光绪帝诊得脉案：“口渴思饮，喉痒呛咳，气不舒畅，心烦而悸，不耐事扰，时作太息。目中白睛红丝未净，视物蒙眬……耳内觉聋，时做轰声。胸中发堵，呼吸语言，丹田气觉不足……夜寐少眠，醒后筋脉觉僵，难以转侧……”
第五种说法：光绪帝有严重的肾亏，加上光绪帝从小身体虚弱，幼多病有长期遗精史。《病原述略》中说：“遗精之病将二十年，前数年每月必发十数次，近数年每月不过二三次……冬天较甚。近数年遗泄较少者，并非较愈，乃系肾经亏损太甚，无力发泄之故。光绪帝有这样一种病症，再加上从几岁起就受慈禧的压制，长期处在紧张之中，后来又在做皇帝时更是经历一连串的挫折和打击，病情逐渐加重，引起一系列呼吸道、消化道等并发病症，最后病亡。这一说法主要依据是光绪生前的病历和光绪生前自己的一段回忆。
究竟哪一个说法更接近于事实呢？光绪帝的确切死因到底是什么？史学界关于光绪死因的辩论从未停止，怀疑谋杀说和正常死亡说几经交锋，却一直没能形成学术定论。
而据最新的研究认为，光绪帝是死于砒霜中毒。中国原子能研究院反应堆工程研究设计所、北京市公安局法医鉴定中心，先后提取了光绪分别长26厘米、65厘米的两小缕头发，清洗后晾干，剪成1厘米长的截段，逐一编号、称重和封装，然后用核分析方法逐段检测光绪头发中的元素含量。
结果显示，光绪头发中含有高浓度的元素砷，且各截段含量差异很大，第一缕头发的砷高峰值出现在第十段(2404微克/克);第二缕头发的砷高峰值出现在第二十六段(362.7微克/克)和第四十五段(202.1微克/克)。而同时对比测试的头发砷含量，当代人为0.14～0.59微克/克，与光绪同时代并埋在一起的隆裕皇后为9.20微克/克，清末一个草料官干尸头发为18.2微克/克。
后来，又按照规范的法医检验要求和方法，提取了光绪遗骨及衣物样品测试，结果肩胛骨、脊椎骨和每件衣物的胃区部位、系带和领肩部位的含砷量很高;内层衣物的含砷量大大高于外层。再对光绪棺椁内、墓内物品和陵区水土等进行对比实验，结果表明光绪头发上的高浓度砷物质并非来自环境沾染。最后他们得出结论：光绪头发上的高含量砷并非为慢性中毒自然代谢产生，而是来自于外部沾染;大量的砷化合物曾存留于光绪尸体的胃腹部，尸体腐败过程进行再分布，侵蚀了遗骨、头发和衣物。而砷化合物也就是剧毒的砒霜。
经过科学测算，光绪摄入体内的砒霜总量明显大于致死量。
按照这一研究，那么就与第一种说法一致——光绪帝是被谋杀的，那么谋害他的最大犯罪嫌疑人就是慈禧。
慈禧为什么一定要谋害光绪帝呢？原因有五。
第一，光绪帝与慈禧太后之间积怨太久，仇恨太深，早已到了势不两立，有我无你、有你无我的地步。在中法战争前，他们之间关系还是友好、亲密的，但由于在中法战争中，他们一个主战一个主和，对战争的分歧太大，他们的关密关系荡然无存，矛盾和仇恨开始出现。后来经过光绪“亲政”、甲午战争、戊戌变法失败、准备废掉光绪帝的大阿哥事件、光绪爱妃被害等等事件，他们之间已到仇深似海、你死我亡的地步。慈禧也多次想害死光绪帝，慈禧极为害怕自己死后，光绪报复她，让她死后不得安宁、死不瞑目，所以她预先设计毒死了光绪。
第二，慈禧历来心狠手辣，狠毒无比，她是公认的中国历史上三个最狠毒的女人之一(其他二位是吕后、武则天)，被她害死的人不计其数。比如：肃顺、珍妃。所以对既是她侄子，又是她外甥的光绪，她也会毫不留情地下杀手。
第三，不管光绪帝是否有痨病、肾病，但这两种病都没有严重到致他于死地的地步。大家知道痨病到了不停地大口吐血的地步，才是比较严重。在光绪的病历中根本没有“吐血”记载，说明光绪的痨病不是很严重。因此光绪死于痨病、肾病的说法是不能成立的。另外光绪死前几天的病历突然将光绪的病描述得很严重，使人感觉到光绪是正常死亡。这一点十分可疑，请不要忘记了给光绪帝看病的全部过程都在慈禧监视和掌握之下，光绪死前几天的病历极有可能是慈禧出于不可告人的目的派人“伪造”的。
第四，戊戌变法失败后，慈禧太后将光绪帝关在中南海瀛台，整整十年间，光绪帝一直处在囚禁状态。瀛台是中南海一个四面环水的小岛，与陆地相连的只有一个木板桥，岛上慈禧派人二十多个心腹太监日夜严密监视光绪。整个紫禁城、中南海已是戒备森严，加上瀛台更严密的保安措施，外人是难以进入瀛台的，更何况你根本不熟悉中南海一带的地形。并且光绪帝吃住还有一套安全程序。别说外人，就是一个长期生活宫中的人都难以接近皇帝。所以根据以上情况推断，害死光绪帝的不可能是袁世凯，只有严密控制中南海、瀛台，大权在握的慈禧才有最大嫌疑。
第五，光绪帝在死亡前一天，向全国发布诏令，命令各地总督巡抚寻找名医名方，推荐进京，为皇帝治病。这件事起码说明了两点，一是皇帝这时非常清醒，不像一个意识模糊、即将升天的人;二是皇帝对治好自已的病充满信心。但是就在第二天皇帝就突然死了，令人感到奇怪。还有一点更让人奇怪的是：就在同一天，也即在慈禧死之前二天，清朝廷以光绪帝的名义发布两道诏令。
第一道：命醇亲王之子溥仪，在宫内教养，并在上书房读书。
第二道：授溥仪之父载沣为摄政王。这两道诏令意思很清楚，一旦皇帝升天，就让溥仪继位，让溥仪父亲载沣主持朝政，辅助年幼的新皇帝。这两道命令是谁下的？不可能是光绪帝，因为光绪帝早已无权力，更没有可能指定自己的接班人。最有可能下这道命令的人是谁？慈禧。
为什么慈禧要下这两道诏令？从中看出两个问题。
一、慈禧自己的病已非常严重，到了最后关头，已到了不得不对后事进行安排的地步。但这一天光绪正好下诏令遍求全国名医，为他治病。
二、慈禧已经决定，要光绪帝死在她自己之前。道理很简单，如果光绪死在她后面，这两道诏令就成了一纸空文。因此，慈禧发了两道诏令，就是要光绪帝在她之前死。
果然，诏令下达第二天，光绪升天，溥仪继位，载沣监国，第三天，慈禧呜呼哀哉，上了西天。结果与慈禧设计的一样。
由此可见，关于光绪死因，第一种说法似乎更接近于真相。
